線虫gRNA-Cas9 共発現ベクター

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9)システムは様々な生物種でin vitroおよびin vivo遺伝子機能破壊を行うことできます。このゲノム編集システムでは、Cas9はガイドRNA（gRNA）と複合体を形成し、ゲノム内の相補的な18-22 ntの標的配列と直接相互作用することによって特異的なターゲッティングを実現します。Cas9はgRNAに相補的な配列につづいてプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）NGGを持つゲノム配列を切断します。切断された2本鎖DNAは相同組換え、または非相同末端結合によって修復された結果、様々な長さのインデル（ゲノム中の塩基の挿入または欠失）が生じます。

線虫（C. elegans）にCRISPR/Cas9遺伝子編集を行うためには、All-in-oneベクター（Cas9-gRNA共発現ベクター）または個別のCas9およびgRNA発現ベクターを細胞に同時に導入することで、ノックアウト株を作製できます。All-in-oneベクターは線虫のコドンに最適化されたCas9（CeCas9）とｇRNAを共発現できます。プラスミドは線虫の生殖腺の遠位に注入することによって、生殖細胞の核に導入されます。その後、子孫を選抜することで目的の遺伝子ノックアウトを持つ安定変異系統を得ることができます。

線虫で効率的なCRISPR/Cas9遺伝子編集を行うために、ベクタービルダーはgRNA-Cas9共発現ベクターを開発しました。線虫U6プロモーターの制御下でｇRNAは発現します。CeCas9 mRNAは強力な線虫プロモーターft-3から転写され、polyAを持つ線虫UTRによって停止します。

このベクターシステムについての詳細は以下の論文をご参照ください。

弊社のプラスミドCRISPRベクターは、大腸菌での高コピー数と高効率トランスフェクションのために最適化されています。このシステムは、gRNA-Cas9共発現ベクターを用いて線虫の効率的なゲノム編集を実現するように最適化されています。

簡便さ: ウイルスベクター作製やウイルス製造などは高い技術が必要となりますが、プラスミドのインジェクションは技術的に簡便です。

安定した変異導入: CRISPR/Cas9遺伝子編集を生殖細胞に実行することで、安定した変異株を作製できる。

遺伝子導入の不均一性： 高コピーの遺伝子を導入できるが、導入コピー数にばらつきが出やすい。ある細胞では多くのコピーが導入されるが、他の細胞では少数コピーのみが導入されたり、全く導入されない場合もある。

PAMが必要：CRISPR/Cas9システムはgRNA認識配列の3’末端のすぐ隣にPAMと呼ばれる配列が必要です。

CeU6: 強力な線虫U6 small RNAプロモーター。

gRNA: Cas9の種類に適応するgRNAを使用する。

Terminator: Pol lll転写ターミネーター。Pol lll RNAポリメラーゼによって転写されたsmall RNAの転写を停止する。

eft-3: 線虫の体細胞で強力な活性を持つef1ɑ プロモーター。

Kozak: Kozak配列。真核生物では翻訳開始を促進すると考えられており、目的ORFの開始コドンの直前に配置される。

CeCas9: gRNAが結合する配列でDNAを切断するCRISPR関連エンドヌクレアーゼ。線虫コドンに最適化されたS. pyogenes Cas9であり、複数の合成イントロンとC末端核局在シグナル、HAタグを持つ。

unc-54 3’ UTR+polyA: 線虫由来Myosin-4 3' UTRと下流polyAシグナル配列。Pol II RNAポリメラーゼによって転写されたmRNAの転写停止とポリアデニル化に必要。

Ampicillin:  アンピシリン耐性遺伝子。　E.coliへのアンピシリン耐性によるプラスミドの維持を可能にする。

pUC ori: pUC複製起点。E.coliでプラスミドを高コピーで維持する。